由于鸡感染后的临床症状差别很大，不同宿主对感染的反应也不一样，这使诊断更为复杂。因此依据单一临床症状不能作为诊断ND的基础。若出现强毒力病型的有关症状和病变应怀疑本病。
一、病理学诊断
1、临床诊断
（1）体温升高，精神抑郁，食欲下降或废绝；
（2）鸡冠、肉髯发绀，嗉囊积液，拉黄绿色粪便；
（3）发病3-5天后出现神经
症状：颈部扭曲、仰头观星、抽搐或麻痹；
（4）呼吸困难，产蛋下降20%-70%，蛋壳褪色、变薄、变脆，软壳蛋和畸形蛋增多。
2、病理变化
（1）气管充血、出血，有大量黏液，嗉囊内有酸臭液体；
（2）腺胃乳头水肿、出血或有白色脓性分泌物，肌胃角质层下有出血点、斑或溃疡；
（3）十二指肠、卵黄蒂附近、回盲部的淋巴滤泡肿胀、出血、有枣核样溃疡；
（4）盲肠扁桃体出血、肿胀，直肠有条纹状出血，有事内有
二、病原鉴定诊断
1、样品采集
从死禽采集的样品有口鼻拭子，还有肺、气囊、肠、脾、脑、肝和心组织，这些样品可单独或混合采集。
从活禽采集的样品应包括气管和泄殖腔拭子。在采集样品机会少的地方，除了受感染的或者有相关临床症状的器官和组织外，主要的应是泄殖腔拭子(或粪便)和气管拭子(或者气管组织)。
2、样品处理
样品置于含抗生素的磷酸盐缓冲液(pH7.0至7.4)中，抗生素视具体情况而变化，但对组织和气管拭子应含青霉素(2000单位/ml)，链霉素(2mg/ml)，卡那霉素(50μg/ml)和制霉素(1000单位/ml)，而对粪便和泄殖腔拭子其浓度要提高5倍。加入抗生素后调节pH值到7.0至7.4是很重要的。粪便和搅碎的组织，应用抗生素溶液制成10至20％的悬液。样品应尽可能地处理，首先在室温下静置1至2小时。没有条件的话，样品可在4℃保存几天。
3、样品检查
粪便或组织的悬浮液经离心后取上清液，尿囊腔接种至少5个9至11天的SPF鸡胚，在35℃-37℃培育4至7天。收集死的和快死的以及培养结束时活下来的鸡胚尿囊液，于4℃致冷，随后检测尿囊液的HA活性。阴性者至少用另一批蛋再传代一次。
用特异性的抗血清可以证实NDV的存在，通常使用鸡的抗血清，它们是用NDV毒株中的一个毒株制备的。
试验以相同的血清PBS作连续对倍稀释，每孔0.025ml，随后每孔加入4个血凝单位的抗原0.025ml，作用15至30分钟后，加入1％的0.025ml鸡红细胞，轻轻混匀，45分钟判定结果。能完全抑制4个抗原的血清最高稀释度即为血凝抑制(HI)滴度。将板倾斜判读，凝集试验更准确。只有那些孔的红细胞同不含病毒对照孔的红细胞出现相同的“流动”时才认为是血凝抑制。
有些非鸡的禽类血清含有对鸡红细胞所特有的非特异性凝集素，因此，可用鸡血红细胞吸收试验血清，以排除凝集素或者采用研究对象的动物种的红细胞。
4、分离株毒力评价
不同NDV分离株的毒力很不相同，而且由于新城疫活苗的广泛应用，仅从具有临床症状的病禽分离出病毒进行鉴定，不能构成对ND的诊断，还应进行分离物毒力的评定。NDV分离株的致病性不能在体外进行，所以评估致病性常根据下面一种或多种试验来确定。
（1）鸡胚平均死亡时间
将新鲜的感染尿囊液用生理盐水连续10倍递增稀释成6Log10～9Log10，每个稀释度接种5个9至10日龄的SPF鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，随后置于37℃。剩余下的病毒稀释液保存于4℃，于8小时后，每个稀释度接种另外5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1ml，置于37℃养。每天观察二次，共观察7天。每次观察都要记录每个鸡胚死亡的时间。
利用鸡胚平均死亡时间可将NDV株分为强毒力型，其死亡时间低于或等于60小时；中等毒力型，其死亡时间在61至90小时之间；温和型，其死亡时间大于90小时。
(2)
脑内致病指数
4Log2
以上血凝滴度的新鲜感染尿囊液，用等渗无菌盐溶液作10倍稀释，不加添加剂，脑内接种1日龄的SPF雏鸡，共接种10只，每只接种0.05ml。每24小时观察一次小鸡，共观察8天。每一天观察应给鸡打分，正常鸡记作0，病鸡记作1，死亡鸡记作2，脑内致病指数是每只鸡8天内所有每次观察数值的平均数。最强毒力病毒的脑内致病指数将接近最大值2.0，而温和型毒株的值接近0。
(3)
静脉致病指数
血凝滴度高于4Log2的新鲜的尿囊液用灭菌等渗盐水作1∶10稀释，由静脉接种6周龄的SPF小鸡，接种10只，每只接种0.01ml。每天观察一次，共10天。每次观察要记分，正常鸡记作0，病鸡记作1，瘫痪鸡记作2，死亡鸡记作3，静脉致病指数是指10天内每次观察每只鸡记录的平均数。温和型毒株和一些中等毒力型毒株的值为0，而强毒力型毒株可达到3.0。
但这些试验也可有较小的改动。用未稀释的尿囊液擦拭6周龄的鸡的泄殖腔和结膜代替上述试验，其目的在于区别亲内脏的强毒力型和其他强毒力型病毒。
三、血清学诊断
ND
病毒可作为抗原，用于各种血清学试验，例如中和试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。目前大都使用血凝抑制试验。鸡血清在这种试验中很少有非特异性反应，所以血清不要作预处理。除鸡以外的其他禽种血清，有时对鸡的红细胞有凝集作用，故试验前应首先测定这种特性，然后用鸡红细胞对试验血清进行吸附，以排除非特异性凝集。
在诊断中血清学的值同感染家禽的免疫状态有关。如果按1∶8稀释的血清或者高于这个稀释度能抑制4个血凝单位的抗原，被判为阳性。为评价鸡群的免疫状况可用血凝抑制试验，当我们正在对免疫过的鸡群进行监测，有可能检出突然升高的抗体应答，这是野毒感染所致，但应注意其他原因引起的变化，例如已免疫新城疫病毒的火鸡再感染PMV～3病毒时，滴度会升高。